طور موفقیت آمیزی مورد استفاده واقع شده است.

Transcript

1 مروری جامع و ضروری بر PCR انواع و کاربردهای آن Downloaded from labdiagnosis.ir at 9: on Monday November 19th 2018 طور موفقیت آمیزی مورد استفاده واقع شده است. کلمات کلیدی: Standard PCR- Variants, RT-, PCR, qpcr, RT- PCR /qpcr combined رضا بهلولی خیاوی کارشناس ارشد میکروب شناسی دانشگاه علوم پزشکی اردبیل شبکه بهداشت و درمان شهرستان مشگین شهر چکیده اختراع واکنش زنجیره ای پلیمراز )PCR( نقطه عطفی در تاریخ علوم زیستی و پزشکی است. کاربرد PCR نه تنها به طور کامل در زمینه تحقیقات ژنتیک مولکولی به خصوص در بیوتکنولوژی جانوری و گیاهی انقالبی ایجاد کرده است بلکه این تکنیک ارتباط و کارایی مبتکرانه خود را در زمینههای دیگر علم پزشکی قانونی سیستماتیک مولکولی اپیدمیولوژی مولکولی باستان شناسی مردمشناسی ژنتیک تکاملی و غیره نیز ثابت کرده است. PCR سنتی منجر به ظهور RT-PCR qpcr و ترکیب RT-PCR/qPCR شده است. همچنین PCR قادر است با موفقیت»پروژه ژنوم انسان«را از طریق توانایی تکثیر و توالی یابی ژنهای انسان تکمیل کند که بیشتر پایه و اساس مهندسی ژنتیک شده است و حتی در حال حاضر ایجاد تغییرات مفید در ژنوم یک ارگانیسم را امکان پذیر ساخته است. واریانت های PCR در بسیاری از پیشرفت های اخیر که علوم دوره مدرن را ایجاد کرده اند به عادل نصیری کارشناس علوم آزمایشگاهی دانشگاه علوم پزشکی اردبیل شبکه بهداشت و درمان شهرستان مشگین شهر سیده نگار مدرس صدرانی کارشناس ارشد بیوشیمی دانشگاه علوم پزشکی اردبیل فاطمه فرجی مزرعه خلفی کارشناس علوم آزمایشگاهی دانشگاه علوم پزشکی اردبیل شبکه بهداشت و درمان شهرستان مشگین شهر مقدمه واکنش زنجیره ای پلیمراز )PCR( سنگ بنا در زمینه ژنتیک مولکولی توسط James D. Watson و Francis Crick در سال 1953 با ارائه مدل ساختار دو رشتهای DNA گذاشته شد. در اوایل 1960 توسط دکتر Gobind Khorana برنده جایزه نوبل در سال 1968 پیشرفت های قابلتوجهی جهت روشن سازی کد ژنتیکی و سنتز اولیگونوکلئوتیدها که به عنوان الگوی پرایمری برای DNA پلیمراز استفاده میشوند حاصل شد. در سال 1971 Kleppe Kjell پژوهشگر آزمایشگاه Khorana همانند سازی قطعهای تاج الدین اکبرزاده خیاوی کارشناس ارشد میکروب شناسی دانشگاه علوم پزشکی اردبیل موسسه آموزش عالی سالمت شهرستان مشگین شهر زهرا رخشیدن کارشناس ارشد ژنتیک دانشگاه علوم پزشکی اردبیل شبکه بهداشت و درمان شهرستان مشگین شهر 57

2 کرد. توصیف پرایمری دو سیستم از استفاده با را DNA از که است آزمایشگاهی تکنیک یک پلیمراز ای زنجیره واکنش برابرآن میلیونها به را DNA از قطعهای تکثیر و سازی همانند )PCR( پلیمراز ای زنجیره واکنش تکنیک میسازد. پذیر امکان وی که وقتی 1983 سال در Kary Banks توسطMullis Emeryville Cetus موسسه در بیوتکنولوژیست عنوان به سرمایه 1985 سال در شد. ابداع میکرد کار آمریکا کالیفرنیای Perkin-Elmer و Cetus موسسه بین مشترک گذاری چرخه ابزار طراحی جهت بیوتکنولوژی آمریکایی شرکت دیگر 1987 در و گرفت صورت PCR برای ها معرف و حرارتی و»PCR-1000 Thermal Cycler«تجاری دسترسی خبر مطبوعات جایزه اختراع این کردند منتشر»AmpliTaq پلیمراز DNA«در را ژاپن جایزه همچنین و شیمی در را خود افتخارات نوبل کرد. خود آن از 1993 سال استاندارد PCR برای الزم اجزای واکنش: مخلوط اجزای حرارت به مقاوم پلیمرازهای Taq /دیگر الگو DNA پرایمرها )dntps( فسفاتها تری نوکلئوتید داکسی MgCl 2 پالستیکی/دستکش خودکار/ظروف پیپت سایکلر( )ترمال حرارتی چرخه دستگاه حرارت به مقاوم پلیمرازهای دیگر و Taq ترموفیلوس Thomas D. Brock 1969 سال در موجود دوست گرما باکتری از جدیدی گونه اکواتیکوس Yellowstone ملی پارک گرم آب چشمه زیرین بخش در»پلیمراز حرارت به مقاوم آنزیم 1976 سال در کرد. جداسازی 1986 سال در شد ایزوله Thermus aquaticus از»Taq خبر PCR در را Taq پلیمراز از استفاده HenryErlich از وسیعی طیف در را خود فعالیت میتواند آنزیم این چون داد PCR مخلوط به آن کردن اضافه کند حفظ باال حرارت درجه DNA دستی کردن اضافه به نیاز بدون را PCR روند کل تر کوتاه واکنش چرخه هر در اشریشیاکلی از تازه پلیمراز گرمایش تحمل به قادر کلی اشریشیا پلیمراز DNA زیرا میکند سنتز در پلیمراز Taq سنتیکی مسیر نیست. سریع سرمایش و و Rothwell وسیله به ها نوکلئوتیدی واردکردن با الگو رشته DNA از بسیاری است. توصیفشده 2005 ردWaksman میتوان که اند شده کشف نیز حرارت به مقاوم پلیمرازهای معموال 1( )جدول کرد استفاده آنها از کاربردشان برحسب واکنش مخلوط از 50μl در Taq پلیمراز DNA 1-1.5Uاز خلوص درجه )مثل ها مهارکننده اگر حال این با است. نیاز مورد مقدار باشد داشته وجود واکنش مخلوط در الگو( DNA پایین بهتر بازده حصول جهت (2-3U) Taq پلیمراز DNA باالی است. الزم تکثیرشده محصوالت الگو DNA یا پالسمید DNA برای الگو DNA از ng معموال تام مخلوط 50μl در ژنومی DNA برای 0.1-1µg و فاژ سبب مقدار این از بیشتر الگوی DNA است. نیاز مورد واکنش بنابراین میشود PCR اختصاصی غیر های فرآورده تولید خیلی مقدار وجود حتی که طوری به باشد خالص باید DNA در استفاده مورد غیره و K پروتئیناز EDTA فنول از جزئی مهار را Taq پلیمراز DNA فعالیت شدیدا DNA جداسازی پلیت شستشوی و اتانول با DNA رسوب اینحال با میکند. نمونه از ها آلودگی این حذف در معموال %70 اتانول با DNA هستند. مؤثر DNA پرایمرها داخل در هدف های جایگاه تکثیر برای مهم بسیار موضوع عمدتا موفق پرایمر است. پرایمر طراحی ژنوم از ای ناحیه یک میشود. طراحی کارایی و ویژگی یعنی هدف دو به دستیابی برای کاذب مثبت نتایج از پیشگیری جهت پرایمرها که صورتی در دستیافتنی اهداف این هردوی شوند طراحی کافی دقت با ذهن در باید پرایمر طراحی هنگام که مالحظاتی زیر در میباشند. است. شده آورده باشیم داشته واکنش ویژگی با مستقیم طور به پرایمر یک طول پرایمر: طول مشخص را دمایی پرایمر طول همچنین است. متناسب PCR معموال شد. خواهد متصل الگو DNA به پرایمر آن در که میکند چه اگر شوند می طراحی باز 24 تا 18 بین طولی در پرایمرها شماره بهار تشخیص- و آزمایشگاه فصلنامه

3 شود. می تعیین ژنوم اندازه وسیله به پرایمر طول حداقل یک T m مقدار زیرا است مهم GC محتوای :GC محتوای و بازی جفت 20 طول با اولیگونوکلئوتیدی کند. می تعیین را توالی سانتیگراد درجه بین T m مقدار معموال CG %50 حاوی درجه 60 تا 40 بین T m باید مطلوب بسیار GC محتوای دارد. C یا G نوکلئوتید سه از بیش وجود از باشد. داشته سانتیگراد منجربه است ممکن زیرا شود اجتناب باید پرایمر '3 انتهای در شود. پرایمر( غیراختصاصی )اتصال اختصاصی غیر پرایمینگ PCR واکنش یک در ازآنجاییکه T(: m ( ذوب دمای سعی باید اینرو از میشوند استفاده پرایمرها از مجموعهای از ها آن T m که شوند انتخاب هایی پرایمری جفت تا شود باشند نداشته اختالف سانتیگراد درجه 5 از بیش همدیگر انتخاب اساس این بر باید پرایمر طول و GC محتوای بنابراین دارد. قرار سانتیگراد درجه دامنه در T m معموال شوند. پرایمرهای برای پرایمر: آنلینگ دمای و ذوب دمای برآورد زیرین فرمول از استفاده با T m تقریبا نوکلئوتید 25 از کمتر های نوکلئوتیدی تعداد G C A T در که شود: می محاسبه هست: پرایمر در مربوطه T m = 4(G+C) + 2(A+T) )منبع( پلیمرازها فالوس( )ترموفیلوس Tfl اشریشیاکلی( T4 )باکتریوفاژ T4 اشریشیاکلی( trxa ژن و T7 )باکتریوفاژ T7 ها آن کاربرد و حرارت به مقاوم پلیمرازهای 1: جدول کاربردها زیستگاه است نشده تعیین است نشده تعیین است نشده تعیین '5 انتهای به نوکلئوتید 3-6 کننده: محدود جایگاه کردن وارد جایگاهی موفقیتآمیزی طور به بنابراین میشود اضافه پرایمر میکند. فراهم شده تکثیر توالیهای در کننده محدود برش برای دیگر مکمل یا خود مکمل نباید پرایمر پرایمر: بودن مکمل وجود از اینرو از باشد واکنش مخلوط در موجود پرایمرهای میتواند زیرا شود پرهیز باید پرایمرها بین و داخل همولوژی شود. پرایمر دیمر ایجاد به منجر بیشتر یا مرتبه 4 برای باز دو یا منفرد باز تکرار از بازها: تکرار شود. پرهیز باید در انتهایی موقعیت :PCR پرایمر در انتهایی نوکلئوتید برای است. ضروری ناجور شدن جفت حذف جهت پرایمر مکمل خود '3 انتهاهای در که پرایمرهایی از آن از پرهیز تشکیل سبب است ممکن امر این زیرا شود اجتناب هستند شود. پرایمر دیمر غیرضروری المقدور حتی ثانویه ساختارهای ایجاد از ثانویه: ساختارهای بین های واکنش نتیجه در ثانویه ساختارهای شود پرهیز باید سرها سنجاق میآیند. وجود به مولکولی درون یا مولکولی ساختارهای نتیجه در همه متقابل دیمرهای خودی دیمرهای شوند. می حاصل ثانویه باال دمای در DNA یابی توالی خون باالی های غلظت تحمل کردن نشاندار صاف انتهاهای تشکیل جهت '5 و '3 آویزان انتهای کردن پر هدایت زایی جهش در دوم رشته سنتز رشته تک حذف کلونینگ ساب پروپ شود( می گفته نیز دار جهت زایی )جهش جایگاه به شده قطعات جای در حذف جایگاه به شده هدایت جهشزایی در رشته بسط DNA آپوپتوتیک منابع Kaledin et al., 1980 Dale et al., 1985; Kunkel et al., 1987; Sambrook et al., 1989 Bebenek et al., 1989; Wood et al., 1993 Mattila et al., 1991 لیترالیس( )ترموکوکوس Vent/Tli دریا عمق هیدروترمال دریچههای فعالیت دارد Taq پلیمراز DNA به نسبت باالیی فعالیت برابر 15-5 '3 اگزونوکلئازی' 5 '5 فعالیت' 3 بر عالوه معکوس ترانسکریپتاز فعالیت خون باالی غلطت تحمل '5 '3 اگزونوکلئازی فعالیت پلیمرازی Myers and Gelfand, 1991 ترموفیلوس( )ترموس rtth ژاپن ایزو در آبگرم چشمه Diaz and Sabino, 1998 ماریتیم( )ترموتوگا Ultma دریایی )زمینگرمایی( ژئوترمال ناحیه ایتالیا ولکانو نزدیک کاگوشیما کداکارا جزیره سولفاتارا ژاپن در '3 اگزونوکلئازی' 5 فعالیت Bensona et al., 2003 کداکارائنزیس( )ترموکوکوس KOD توسط که پیچیدگی هیچ بدون باال گسترش میزان و باال صحت باال پیشروندگی شود می اعمال ترانسفرازی ترمینال فعالیت Cahill, et al., 2003; Kanoksilapatham et al., 2004 Cahill, et al., 2003; Kanoksilapatham et al., 2004 ووئسی( )پیروکوکوس Pwo لوانته پورتو ساحل دریایی رسوبات ایتالیا ولکانو جزیره خون باالی غلظت تحمل '3 '5 اگزونوکلئازی فعالیت فوریئسوس( )پیروکوکوس Pfu لوانته پورتو ساحل دریایی رسوبات ایتالیا ولکانو جزیره خطا میزان پایینترین '3 '5 اگزونوکلئازی فعالیت Kermekchiev et al., 2009 یوبیکویتئوس( )ترموس HotTub است نشده تعیین هدایتشده جهشزایی در دوم رشته سنتز cdna سنتز خون باالی غلظت تحمل پرایمر بسط توسط تکرشتهای( DNA( ssdna های پروپ تولید جایگاه به شماره بهار تشخیص- و آزمایشگاه فصلنامه

4 dntps غلظت هر dntp در مخلوط نهایی واکنش معموال 200µM است و غلظت هر) dttp )dntps,datp, dctp, dgtp, باید یکسان باشد. غلظت نادرست حتی یک dntp منفرد ممکن است سبب افزایش درج اشتباه نوکلئوتیدها در رشته جدید شود. MgCl 2 در طی همانند سازی یک جفت الکترون منفرد در ناحیه 3'-OH زنجیر در حال تکثیر ظاهر می شود که برای تشکیل پیوند فسفودی استر توسط پلیمراز Taq استفاده می شود. این جفت الکترون منفرد جهت تبدیل dntp به dnmp از طریق حمله نوکلئوفیلی بر روی اتم فسفات گروه α- فسفات استفاده شده و پیروفسفات )β و γ( آزاد می گردد اما dntp ورودی چهار بار منفی دارد و به علت وجود این بارهای منفی از حمله نوکلئوفیلی جلوگیری به عمل می آید بنابراین +2 Mg با شالته کردن بارهای منفی اضافی نوکلئوتید ورودی حمله نوکلئوفیلی )هسته دوستی( و تشکیل پیوند و در نتیجه پلیمریزاسیون را تسهیل میکند. همچنین همه آنزیم ها برای فعالیتشان نیاز به کوفاکتور دارند و یون فلزی +2 Mg بهعنوان کوفاکتور ضروری برای DNA پلیمراز در PCR عمل میکند. یون +2 Mg جهت اتصال و ایجاد نیرو وارد پروتئین شده و پلیمراز را قویتر کرده تا بتواند به dntp متصل شود اما به صورت اختصاصی این کار را انجام میدهد بنابراین افزایش غلظت +2 Mg در PCR سبب پیوند قوی میشود اما احتمال تکثیر غیر اختصاصی نیز افزایش مییابد. بدین خاطر غلظت آن باید برای هر سیستم پرایمر الگو بهینه شود. همچنین اجزای دیگر واکنش PCR شامل پرایمرهای الگو محصوالت PCR و dntps به یون +2 Mg متصل میشوند. غیر از این ها dntps تمایل زیادی برای اتصال به یون +2 Mg دارند و به خاطر همین یون +2 Mg آزاد الزم است تا بهعنوان کوفاکتور آنزیم در PCR عمل کند بنابراین غلظت تام یون +2 Mg باید بیشتر از غلظت تام dntp باشد. دامنه غلظت توصیه شده MgCl 2 در مخلوط استاندارد واکنش 1-4mM است. برای پیپتهای خودکار ظروف پالستیکی و دستکش پیپت های خودکار µl) (1-10µl, µl & لولههای میکروسانتریفویوژی 0.2ml-1.5ml سرسمپلرها محل PCR و غیره در طول PCR و برای بارگذاری محصوالت تکثیر یافته در ژل آگارز الزم هستند. ترمال سایکلر )سایکلر حرارتی( ابزاری است که دما را در طول هر چرخه برای دناتوراسیون آنلینگ بسط و روند نگهداری بسیار سریع تغییر می دهد. اصول روش و آشکارسازی پس از تکثیر PCR اصول PCR اصول PCR بر پایه این واقعیت استوار است که در دمای دناتوراسیون باال نزدیک 95 درجه سانتیگراد دو رشته مولکول DNA هدف به علت شکستن پیوندهای A-T و G-C از هم جدا میشوند. در دمای های آنلینگ در دامنه درجه سانتیگراد پرایمرهای مکمل جلو )Forward( و معکوس )Reverse( به انتهای '3 اتصال یافته و مولکول DNA هدف تک رشتهای را از دو طرف محصور می کنند. سپس پلیمراز Taq رشته جدید DNA را با اضافه کردن dntp ها توسعه داده و مولکول دو رشته ای خودش را در دمای توسعه 72 درجه سانتیگراد بازسازی می کند. این روند چند بار تکرار شده و چندین نسخه از مولکول DNA هدف را به وجود میآورد )شکل 1(. برای نتایج بهتر دستوالعمل های عملی شبکه کیفی ژنتیک مولکولی اورپا )EMQN( باید مورد مطالعه قرار گیرد. 60

5 روش انجام پروژه ابتدا دناتوراسیون در دمای درجه سانتیگراد به مدت 3-5 دقیقه صورت می گیرد و طی آن دو رشته مولکول DNA دو رشته ای هدف از هم جدا می شوند. دناتوراسیون اولیه توسط چرخه دناتوراسیون آنلینگ و توسعه دنبال می شود. تعداد چرخه PCR بستگی به مقدار DNA الگو در مخلوط واکنش و بازده مورد انتظار محصول PCR دارد. دناتوراسیون شامل حرارت دادن مولکول DNA دو رشته ای هدف در دمای به مدت ثانیه است. مرحله آنلینگ اجازه اتصال پرایمرهای مکمل Forward و Reverse به ناحیه طرفین DNA الگو را در دمای درجه سانتیگراد در مدت ثانیه می دهد. مرحله بسط پرایمر در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت ثانیه رخ میدهد و طی آن dntp های مکمل به رشتههای جدید اضافه میشوند. پس از چرخه نهایی معموال نمونهها در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 5-15 دقیقه جهت پر کردن انتهاهای بیرون زده محصوالت PCR جدیدا سنتز شده انکوبه می شوند. ذخیره و نگهداری محصوالت PCR در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت زمان نامحدود میتواند صورت بگیرد. آشکارسازی پس از تکثیر پس از الکتروفورز محصول PCR توسط ژل آگارز ژل آگارز با محلول اتیدیوم بروماید )EtBr( رنگ آمیزی می شود و سپس در زیر تابش نور UV محصول PCR در ژل بهصورت رنگ صورتی مشاهده میشود. اتیدیم بروماید سال های زیادی برای رویت اسیدهای نوکلئیک در ژل آگارز استفاده شده است. البته اتیدیم بروماید جهشزای بالقوه بوده و سبب جهش در سلول های زنده می شود بنابراین ژل باید در یک ظرف زباله اختصاصی گذاشته شود که با عالمت خطر نشان دار شده و تاریخ گذاری شده و به بخش زیست محیطی و ایمنی تحویل داده شود. انواع PCR واریانت های PCR استاندارد )RT-PCR( رونویسی معکوس -PCR )qpcr( کمی PCR در زمان واقعی یا PCR ترکیب RT-PCR/qPCR واریانت های PCR استاندارد تغییر در تکینک پایه ای PCR منجر به پیشرفت واریانتهای PCR شد که در زیر توصیف شده اند: PCR ویژه آلل )Allele specific PCR (Tetra-primer ARMS PCR(( PCR ویژه آلل امکان شناسایی مستقیم جهش نقطهای در DNA را می دهد. این تکنیک به دانش قبلی درباره توالی DNA هدف مثل اختالف بین آلل ها نیاز دارد و از پرایمری با انتهای '3 ناجور در برگیرنده تغییرات تک نوکلئوتیدی بهره میبرد. دو پرایمر ویژه آلل یکی برای هر آلل SNP )پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی که بهصورت snip تلفظ میشود( مورد نیاز است که یکی از دو پلیمورفسیم تک نوکلئوتیدی موجود در انتهای '3 را پوشش می دهد )شکل 2(. ممکن است پرایمر معمول Forward و Reverse استفاده شوند. بهطور کلی دو واکنش PCR برای شناسایی دو آلل یک SNP الزم است. )Asymmetric PCR( نامتقارن PCR این واریانت PCR ترجیحا برای تکثیر یکی از رشته های مولکول DNA هدف با استفاده از غلظت نابرابر پرایمر به کاربرده میشود به طوریکه چنین همانند سازی از روی علم ریاضیات با استفاده از پرایمر مازاد رخ می دهد. )Colony کلونی) PCR PCR نوعی از PCR است که بهطور روتین در مطالعات ژنوم باکتریایی استفاده می شود. درج پالسمیدهای دارای تعداد نسخه باال مثل puc19 puc18 یا pbluescript در باکتری ها به طور معمول برای هدف های مختلف انجام میشود و PCR کلونی سریعا درج این پالسمیدها را غربالگری میکند. این روش دارای چند مزیت بر روشهای سنتی غربالگری آبی سفید است زیرا میتواند هردوی اندازه و جهت درج ناقل را تعیین کند. در حقیقت کلونی های سفید عالوه بر غربالگری از طریق روش آبی سفید سنتی توسط روش PCR کلونی هم غربالگری می شوند تا از توالی یابی کلونهای مثبت کاذب پرهیز شود. عالوه براین PCR کلونی به تولید مقدار کافی محصول مطلوب PCRبه منظور توالی یابی کمک میکند. 61

6 )Degenerate دژنره) PCR PCR واریانتی از PCR است که پرایمرهای دژنره را جهت تکثیر توالی ناشناخته پیوسته به توالی DNA شناختهشده به کار می گیرد. پرایمرهای دژنره بر پایه همولوژی ژن شناخته شده و توالی یابی شده طراحی میشوند. این تکنیک شناسایی اعضای جدیدی از خانواده ژنی یا ژنهای اورتولوگ از ارگانیسم مختلف را امکان پذیر می سازد. )Hotstart PCR( هات استارت PCR این تکنیک شامل مراحل PCR سنتی است به جز این که پلیمراز Taq زمانی به مخلوط واکنش اضافه می شود که بقیه اجزای PCR تا دمای ذوب DNA حرارت دادهشدهاند بنابراین از تکثیر غیر اختصاصی در دماهای پایین جلوگیری میکند. یا بهطور جایگزین می توان از مهارکننده هایی با اتصال کواالن به پلیمراز استفاده کرد که فقط پس از رسیدن مخلوط T m از آن جدا می شوند. واکنش به )Inverse معکوس) PCR PCR در حالیکه PCR مرسوم به جفت پرایمر مکمل برای هر دو انتهای '3 DNA هدف نیاز دارد PCR معکوس امکان تکثیر DNA را فقط با یک توالی شناخته شده می دهد. این تکنیک نیازمند یک برش و اتصال محدود کننده در توالی است که منجر به تشکیل قطعه DNA حلقوی می شود که میتوان از توالی شناختهشده آن به عنوان جایگاه اتصال پرایمر جهت انجام PCR استفاده کرد. PCR مینی پرایمر )Miniprimer PCR( روش PCR استاندارد به پلیمراز Taq نیاز دارد که کارایی آن در سنتز DNA به علت نیاز به پرایمرهای طویلشان )30-20 نوکلئوتید( از دیگر آنزیم های همانند ساز کمتر است بنابراین روش جدید PCR به نام PCR مینی پرایمر توسعه یافت. 62

7 در این PCR پلیمراز Taq مهندسیشده و مینی پرایمر با طول 10 نوکلئوتید استفاده شده است. PCR مینی پرایمر در درک بیولوژی میکروبی جهت شناسایی توالی DNA محافظت شده طی تکامل مثل 18S rrna)16s rrna یوکاریوتی( سودمند است که با PCR استاندارد غیر ممکن است. Xu و همکاران نقش PCR مینی پرایمر را با استفاده از تیتانیوم پلیمراز Taq و پرایمرهای کوتاه برای ژنوتایپینگ )تعیین ژنوتیپ( زیرگونه پانتوآ استوارتی ای ارزیابی کردند که عامل سببی فساد باکتریایی استوارت در ذرت است. )Multiplex PCR( چندگانه PCR PCR چندگانه تغییر PCR به منظور شناسایی سریع حذفها یا مضاعف شدگیها در یک ژن بزرگ است در 1988 حذف در ژن دیستروفین نخست با روش PCR چندگانه شناسایی شد. PCR چندگانه از مجموعه پرایمر چندگانه در داخل یک مخلوط منفرد PCR جهت تولید آمپلیکون با اندازههای مختلف و اختصاصی توالیهای مختلف DNA استفاده می کند. این واریانت PCR چندین ژن را در یک آزمون منفرد مورد هدف قرار می دهد که به عبارت دیگر جهت انجام آن چندین برابر معرف و زمان بیشتر مورد نیاز خواهد بود )شکل 5(. طول جفت باز آمپلیکون ها باید تفاوت کافی را جهت جدا سازی بهتر و تشکیل باند مجزا داشته باشند تا به راحتی در ژل مشاهده شوند. PCR چندگانه در بسیاری از زمینههای آزمون DNA مثل آنالیز حذف ها جهشها و پلی مورفیسم ها میکروساتالیت ها )ریز ماهواره ها( و SNP ها بهطور موفقیتآمیزی استفاده شده است. )Nested PCR( آشیانه PCR تغییر PCR جهت به حداقل رساندن تکثیر غیر اختصاصی و محصوالت کاذب PCR طراحی می شود که امکان داشت سبب اتصال پرایمر به جایگاه های پیشبینیشده و ناخواسته مشابه DNA هدف شود. PCR آشیانه شامل 2 مجموعهای از پرایمر است که آنها در دو اجرای )ران( پیدرپی واکنش PCR استفاده میشوند )شکل 6(. عملکرد مجموعه دوم پرایمر این است که به جایگاه هدف دوم در داخل توالی تکثیر شده با مجموعه اول پرایمر اتصال یابند. به طوری که بسیار بعید است که توالی کاذب یا ناخواسته جایگاه اتصال برای هر دو مجموعه پرایمر ها داشته باشد. 63

8 Touchdown PCR این تکنیک قادر است با استفاده از انجام مراحل اولیه چرخههای PCR در دماهای باال از تکثیر توالیهای غیر اختصاصی ممانعت کند و در چرخههای بعدی دمای آنلینگ رفته رفته کاهش می یابد )شکل 7(. این امر امکان اتصال اختصاصی پرایمر در باالترین دما را می دهد که حداقل مجاز برای اتصال غیر اختصاصی است و فقط توالی هدف را تولید می کند. PCR رونویسی معکوس Reverse Transcription-PCR (RT- PCR) این تکنیک آشکارسازی کمی مقدار بیان RNA را به وسیله تولید DNA مکمل )cdna( از RNA با کمک آنزیم رونوشت بردار معکوس و به دنبال آن تکثیر cdna با استفاده از PCR استاندارد را ممکن می سازد. Howard Temin از دانشگاه Wisconsin Madison آنزیم رونوشت بردار معکوس را در ویروس روس سارکوما )RSA( کشف کرد که بعدا بهطور مستقل توسط David Baltimore در سال 1970 از دو ویروس توموری RNA دار: R-MLV )ویروس لوکمی رائوسچر مورین( و RSV جدا سازی شد. هردو دانشمند در سال 1975 بهطور مشترک جایزه نوبل فیزیولوژی یا پزشکی را به خاطر دستاوردهای فوقالذکر دریافت کردند. آنزیم رونوشت بردار معکوس شامل یک DNA پلیمراز وابسته به RNA یک فعالیت DNA پلیمرازی وابسته به DNA و ریبونوکلئاز H هستند که جهت انجام رونویسی با هم عمل می کنند. عالوه بر عملکرد در فرآیند رونویسی آنزیمهای رونوشت بردار رتروویروسی دارای یک دومین متعلق به خانواده RNase H هستند که جهت همانند سازی آنها حیاتی هست. ایده رونویسی معکوس در ابتدا زیاد مورد استقبال قرار نگرفت زیرا هسته مرکزی بیولوژی مولکولی Dogma( )Central را نقض میکرد اما سرانجام در سال 1970 زمانی که Howard Temin و David Baltimore بهطور مستقل آنزیم مسئول رونویسی معکوس به نام رونوشت بردار معکوس را کشف کردند پذیرفته شد. رونوشت بردارهای معکوس رتروویروسی مانند ویروس میلوبالستوزیس ماکیان )AMV( و ویروس لوکمی موش مولونی )MMLV( از رونوشت بردارهای بسیار شناخته شده هستند که در زمینه بیولوژی مولکولی استفاده میشوند. رونوشت بردار معکوس بسیار رایج برای الگوهای طویل mrna رونوشت بردار معکوس M-MLV است زیرا فعالیت RNase H آن ضعیفتر از رونوشت بردار معکوس AMV )که بهطور معمول استفاده میشود( می باشد. پیشرفت در زمینه مهندسی ژنتیک و گسترش بافرهای افزاینده فعالیت ترانسکریپتازی )RT( سبب دسترسی آنزیمهای جدیدی شد که کارایی باالتری نسبت به ترانسکریپتازهای طبیعی داشته و دارای مقادیر باالی مقاومت حرارتی و عمر مفید طوالنی در 50 درجه سانتیگراد هستند. امروزه رونوشت بردار معکوس M-MLV مورد استفاده از اشریشیاکلی تلخیص میشود که ژن M-MLV pol بر روی پالسمید را بیان می کند. درحالیکه سلولهای حشرات عفونیشده با باکولوویروس دارای ژن pol ویروس میلوبالستوزیس ماکیان )AMV( جهت تلخیص رونوشت بردار معکوس AMV استفاده میشوند. دو روش مقدماتی برای انجام RT-PCR وجود دارد یعنی روش یک مرحله ای و دو مرحله ای )شکل 8(. در روش یک مرحله ای تمام اجزا شامل پرایمرهای اختصاصی در داخل یک 64

9 لوله منفرد گذاشتهشده و به همان صورت واکنش PCR نیز صورت میگیرد. در روش دو مرحلهای واکنش اول شامل تشکیل cdna با کمک واکنش مجزای ترانسکریپتاز معکوس است سپس cdna به واکنش PCR اضافه میشود. روش یک مرحلهای بسیار سودمند است زیرا زمان کمی میبرد و ارزان بوده و نیاز کمی به دستکاری نمونهها دارد بنابراین خطای پیپت کردن آلودگی و غیره کاهش می یابد. با این وجود مشکل آنالیز بعدی ژنهای هدفی است که به وسیله پرایمرهای ویژه ژن مورد استفاده در واکنش تک لوله ای جهت تشکیل و تکثیر cdna تکثیر نشدهاند بنابراین کسری RNA از نمونههای اصلی باید جهت آزمون بیشتر ذخیره شوند اما انجام روش دو مرحلهای این مزیت را دارد که در این روش نمونه RNA در یک مرحله استفاده نمی شود و آنالیز بیشتر ژن هدف را امکانپذیر می سازد. C( T یا نقطه تقاطع نامیده می شود بنابراین با آستانه چرخه ( استفاده از رقتهای متوالی DNA استاندارد با مقدار مشخص میتوان مقدار DNA یا cdna نمونه ناشناخته را به عنوان C T با استفاده از ترسیم منحنی استاندارد لگاریتم غلظت ارزش C T محاسبه کرد. qpcr تکثیر و آشکارسازی نمونه در مقابل را در یک مرحله انفرادی با هم انجام می دهد از اینرو نیاز به هر فرآیند پس از تکثیری را از میان میبرد. مزیتهای دیگر Real time-pcr or quantitative PCR (qpcr)qpcr PCR( در زمان واقعی یا PCR کمی( در سال 1992 توسط Higuchi و همکارانش معرفی شد و قادر است به منظور اندازهگیری تکثیر DNA در هر چرخه PCR رنگ فلورسنت گزارشگری مثل سایبر گرین I را آشکارسازی کند در طول فاز خطی لگاریتمی تکثیر فلورسنس تا نقطهای افزایش می یابد که قابل سنجش میشود و بهعنوان 65

10 qpcr حساسیت تعیین پیشرفت واکنش در زمان واقعی سرعت آنالیز و سنجش دقیق مواد مورد آزمون در نمونه است. این امر در نتیجه وجود رنگ های فلورسنس یا پروپ های اولیگونوکلئوتیدی نشان دار با فلورسانس است که شدت آن ها با مقدار محصول DNA تولید شده متناسب می باشد. جهت تسهیل انواع مختلف واکنش های qpcr انواع مختلف پلیمراز استفاده میشوند که این پلیمرازها دارای صحت باال سرعت و مقاومت حرارتی باالیی هستند بنابراین تجهیزات PCR در زمان واقعی جهت انجام این واکنش ها طراحی می شوند که شامل ترمال سایکلر برای تکثیر DNA سیستم نوری برای برانگیختن فلوئور وفورها و گرفتن فلورسنس نشری از شیمی آشکار سازی )شکل 9( و نرم افزار ویژه برای جمع آوری و آنالیز داده های کمی تولید شده است. ترکیب )RT-PCR/ qpcr combined )RT-PCR/qPCR در آشکارسازی کمی بیان RNA واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس )RT-PCR( از طریق تبدیل الگوی RNA به DNA برای تعیین کمی بیان RNA استفاده می شود. هر دو تکنیک RT-PCR و qpcr ادغام شده و این تکنیک ترکیبی RT-PCR -qrt/pcr کمی یا RT-qPCR نامیده می شود. مزایا و معایب تکنیک PCR به خاطر اینکه تکثیر با پرایمرهای مکمل انجام می شود تکنیک بسیار اختصاصی است. به علت تولید میلیونها نسخه از طریق تکثیر در کمتر از سه ساعت روش نسبتا سریعی است. براساس نوع ماده ژنتیکی DNA( یا )RNA تغییرات مناسب را میتوان به راحتی اعمال کرد و تکنیک به راحتی برای طیف وسیعی از کاربردها تقریبا در تمام رده های موجودات از میکروارگانیسمها تا سلسله گیاهان و جانوران قابل استفاده است. در کنار این مزایا و قابلیت اجراء تکنیک معایب بالقوهای نیز دارد. اولین و مهمترین عیب هزینه آن است. در مقایسه با آزمونهای سنتی تکنیکی گران قیمت است. نیز انجام PCR به درجه باالیی از مهارت و تخصص نیاز دارد. عالوه براین جهت انجام PCR باید دانش دقیقی از بیوانفورماتیک برای طراحی پرایمرها برای واردکردن جایگاه های محدود کننده و غیره داشت. این تکنیک فقط در آزمایشگاههایی قابل دسترس است که به طور ویژه ای تکنیکهای آزمون و آنالیز بیولوژی مولکولی را دارند. در بیشتر مواقع اسیدهای نوکلئیک از ارگانیسم های غیر زنده نیز همراه با نمونه مورد نظر تکثیر میشوند. آنالیز نمونه ها پس از PCR پژوهشگر را در معرض مواد شیمیایی مضری مثل اتیدیوم بروماید رنگها فلوئوروکرومها و نور UV قرار می دهد که سرطان زا هستند. 66

11 PCR کاربردهای قانونی پزشکی علم انگشتنگاری DNA نمودن پروفایل در مهمی ابزار PCR به قادر تکنیک این هست. DNA آزمایش و DNA نوع تعیین نمونههای است. دیگر افراد میلیونها میان از فرد یک شناسایی افراد DNA با میتوان را جرم صحنه از استخراجشده DNA DNA نگاری انگشت کرد. مقایسه DNA پایگاه یا مظنون را کودک بیولوژیکی والد شناسایی جهت ابوت تعیین آزمون سازد. می امکانپذیر تشخیصی و پزشکی های بیماری وجود اثبات برای نگر آینده مطالعه یک در این از و داد قرار ژنی آزمایش مورد توان می را والدین ژنتیکی همان برای را آنها فرزندان بودن حامل احتمال میتوانیم رو به میتوان را تولد از پیش آزمایش کنیم. معین ژنتیکی بیماری سلولهای یا کوریونی پرزهای از برداری نمونه آمینوسنتز وسیله وجود احتمال تعیین جهت مادر خون گردش در موجود جنینی از پیش میتوانیم را بافت نیز داد. انجام جنین در جهش بین سازگاری بررسی برای PCR از استفاده با اندام پیوند انجام است( HLA نوع تعیین )منظور نوع تعیین گیرنده و دهنده بر خون نوع تعیین سنتی آزمایش جایگزین روش این کرد. روی بر موجود ژنهای آنتی شناسایی منظور به آنتیبادی پایه درمانی رژیمهای است. شده ها بافت و بدن سلولهای سطح بر مبتنی آزمایش از استفاده با خاص بیماران برای میتوان را در جهش مطالعه منظور به کرد تجویز سفارشی طور به PCR استفاده PCR از توان می سرطان از خاصی شکل در انکوژنها عفونت از پس ها هفته تا HIV علیه های آنتیبادی کرد. گسترش طوری PCR بر مبتنی های آزمایش شوند نمی ظاهر میان از را ویروسی منفرد ژنوم یک حتی شناسایی که اند یافته اهدای مشابه طور به سازند. می امکانپذیر میزبان های سلول می را ویروسی ضد داروهای اثرات و بیماری از بهبودی خون را شده اهدا خون توان می این بر عالوه کرد. بررسی فورا توان Real Time PCR از استفاده با باکتریایی آلودگی وجود برای کرد. بررسی خلط نمونه جمعآوری نیازمند که سل بیماری مورد در PCR بر مبتنی های آزمایش است آزمایشگاه در کشت و امکانپذیر را زنده غیر و زنده ارگانیسمهای هردوی شناسایی آنتی مقاومت شناسایی ژن دقیق آنالیز براین عالوه است. ساخته است. کرده ممکن را درمانی اثرات همچنین و بیوتیکی های ارگانیسم شیوع شناسایی PCR بر مبتنی آزمایشات است. ساخته پذیر امکان وحشی و اهلی حیوانات در را عفونی نتیجهگیری که است ساده حال عین در و پیشرفته بسیار تکنیک یک PCR به پزشکی علوم و بیولوژی های زمینه اکثر در آن پذیری تطبیق شده اثبات نیز کمی نتایج و کیفی نتایج ارائه در آن توانایی علت های تشخیص در آن اجرای قابلیت با همراه PCR ابداع است. تکنولوژی DNA پروفایلینگ DNA انگشتنگاری بالینی دیگر زمینههای در آن نقش از نظر صرف نوترکیب DNA علم به هدیه یک جنایی شناسی مردم باستانشناسی مثل از بسیاری ژنوم و انسان ژنوم توالی تعیین است. بوده مدرن که است شده باعث گیاه گونه چندین شامل دیگر موجودات جهت دیگر اشکال در یا شکل یک در قدرتمند طور به PCR نتیجه در ها پیشرفت این باشد. داشته کاربرد علوم دقیق آنالیز و RT-PCR qpcr با همراه PCR پایهای تکنیک در تغییر کاربرد آینده در است. شده حاصل RT-PCR/qPCR ترکیب ابزار طراحی با همراه بیولوژیکی علوم در PCR از بیشتری جدید بهوجود سازی ریز و نمونه باالی پذیرش ظرفیت دارای پیشرفته باهوش دانشمندان وجود نیازمند ها این همه از باالتر آمد. خواهد برسانند. ثمر به را اختراعات این که هستیم کنجکاوی و شماره بهار تشخیص- و آزمایشگاه فصلنامه

12 References 1- Singh Jagtar Birbian, Niti Sinha, Shweta, Goswami Akshra: A critical review on PCR, its types and applications. International Journal of Advanced Research in Biological Sciences:1(7):65-80: Chou Quin, Russell Marion, E.Birch David, Raymond Jonathan, Bloch Will: Prevention of pre-pcr mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications. Nucleic Acids Research:(( 20):( 7 ) : S.Chamberlainl Jeffrey, A.Gibbs1Richard, E.Ranierl Joel, Nga Nguyen, Caskey C.Thomas : Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Research:(16): D. BROCK THOMAS AND FREEZE HUDSON: Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a Nonsporulating Extreme Thermophile. JOURNAL OF BACTERIOLOGY:: : Diefenbach C.W, Lowe T.M.J, Dveksler G.S: General concepts for PCR primer design. Downloaded from genome.cshlp. Published by Cold Spring Harbor Laboratory Press org on May 9: A. Isenbarger Thomas, Finney Michael, Rı os-vela zquez Carlos, Handelsman Jo, Gary Ruvkun: Miniprimer PCR, a New Lens for Viewing the Microbial World.APPLIED AND ENVIRON- MENTAL MICROBIOLOGY:(74 ):(3) : Diaz R.S, Sabino E.C: Accuracy of replication in thepolymerase chain reaction. Comparison between Thermotoga maritima DNApolymerase and Thermus aquaticus DNA polymerase. Brazilian Journal of Medical and Biological Research :(31): : Joshi Mohini, J.D Deshpande: POLYMERASE CHAIN REACTION: METHODS, PRINCIPLES AND APPLICATION. International Journal of Biomedical Research: available online at 9- Stephen A. Bustin: Real-Time Reverse Transcription PCR. Encyclopedia of Diagnostic Genomics and Proteomics: Polymerase Chain Raction(PCR). From: